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亚硫酸氢钠修饰DNA

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶,而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败,体会如下:  

(1)亚硫酸氢钠的浓度**控制在3.0~3.9 mol/L为好,其pH值**用NaOH精确调整至5.0;  

(2)修饰时间应掌握在10~16 h,修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧,而时间过短会导致修饰不彻底;  

(3)反应温度应控制在50~55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好);  

(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。  

只要遵循以上几点基本上能保证99% 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是,此修饰过程中模板DNA有约96%已经降解。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA),在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1g)作为载体,有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象) 。


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